【摘要】  　　本研究研制新型的血小板冷冻保存液，观察血小板在不同保存液冻存前、后的形态改变，以及体外受凝血酶作用下的活化状态，同时比较添加UDPGal对保存液保存效果的影响。在以往单一应用较高浓度的DMSO为血小板低温保存液的基础上，自行研制新型保存液：2% DMSO+ thrombosol+ UDPGal，在不同时间分别观察血小板形态及测定血小板膜表面糖蛋白CD62P的表达。结果显示，在圆形、树突形、不规则形态的百分比方面冷冻保存对血小板形态有显著影响，2% DMSO+ thrombosol组和2% DMSO+ thrombosol+ UDPGal组保护作用优于5% DMSO组；与新鲜血小板相比，冻存后血小板表达CD62P明显下降，保存1月与3月时CD62P表达无明显差异，3种保存液组之间CD62P表达无明显差异。结论：3种冷冻保存液中2% DMSO+ thrombosol和2% DMSO+ thrombosol+ UDPGal对血小板形态的保持效果相似，均优于5% DMSO组。冷冻保存后血小板对凝血酶的反应下降，3种保存液组之间无明显差异。在保存液中添加UDPGal对保存效果没有明显影响。

【关键词】  血小板；冷冻保存；thrombosol；UDPGal；CD62P

　　Experimental Study on Cryopreservation of Plaets

        Abstract    The study was purposed to develop a novel cryopreserved agent (CPA) for plaets, to investigate the morphology of cryopreserved plaets in different CPA and  the CD62P expression on membrane of plaets after stimulating by thrombin, as well as to compare the effect of adding UDPGal on preserved efficiency of preservation solutions. A novel cryopreserved agent consisting   of 2％ DMSO, thrombosol and UDPGal was developed on  basis of using higher concentration of DMSO. The morphology of chilled plaets was observed by transmission  electron microscope and compared with fresh plaets. The expression  of CD62P    on the membrane of plaets was detected at 0, l, 3 months. The results indicated that the significant effect of cryopreservation on morphology of plaets was found  according to  percentages of round, dendritic  and irregular shapes of cryopreserved plaets. The protective effects of 2% DMSO+thrombosol and 2% DMSO+thrombosol+UDPGal were better than that of 5% DMSO. Compared with fresh plaets, the expression of CD62P on  plaet membrane decreased obviously after cryopreservation, but not observed  difference at preservation for 1 month and 3 months, as well as among 3 kinds of different CPA. It is concluded that the protective effects of 2% DMSO+thrombosol and  2% DMSO+thrombosol+UDPGal on morphology of plaets are similar, but better than that 5% DMSO. The   reaction of cryopreserved plaets to thrombin decreases, while the significant difference is not found among these 3 kinds of CPA. The addition of UDPGal to cryopreseved agents  not show the protective effect on plaets.

    Key words    plaet; lyophilized preservation; thrombosol；UDPGal；CD62P

    随着强化疗和骨髓移植的迅速开展，血小板的需求量大幅增加。然而冷冻保存后的血小板聚集功能降低，且输注后在血循环中很快被清除［1］，极大地限制了其临床应用。目前广泛使用的同种异体单采血小板仅能在22℃保存5天，且存在细菌污染及10%-20％受者发生无效输注的问题［2，3］。血小板保存时间短，采集成本高，约1/3血小板因过期被弃用，造成巨大浪费。因此，如何长期保存血小板成为医学界面临的难题。本研究采用2％ DMSO、thrombosol和UDPGal作为血小板冷冻保存剂，通过电子显微镜观察冷冻前后血小板的形态变化，流式细胞仪检测血小板膜表面糖蛋白CD62P的表达以反映血小板的功能，进而比较不同保护液的作用，以期为今后的临床应用提供实验依据。

     材料和方法

    主要试剂

    二甲亚砜（DMSO）、thrombosol试剂购自Sigma公司，UDP半乳糖（UDPGal）购自Merck公司，CD62PPE单克隆抗体及PE标记的同型单克隆抗体均购自美国Becton Dickinson公司。

    中国实验血液学杂志  J Exp Hematol 2007; 15(2)血小板冷冻保存的实验研究研究对象

    健康志愿者30例，他们的血小板计数不低于180×109/L，按照全国血液质量委员会颁布的供血者健康标准检查合格。

    血小板的采集及冷冻保存

    用Cobe Spectra血细胞分离机（美国产品）采集健康人血小板30份，采集时加入枸橼酸葡萄糖溶液1∶10抗凝，每份血小板含量约为1×1012/L。按以下方法分组保存，每组10份。A组：加5％ DMSO；B组：加2％   DMSO、thrombosol （成分为阿米洛利0.25 mmol/L、腺苷0.1  mmol/L、硝普钠50  μmol/L）；C组：加2％  DMSO、thrombosol、UDPGal 100 μg/L。具体操作为：取30 ml血小板悬液，按组分别加入冻存剂，使其达到各组要求的终浓度，充分震荡使血小板与冻存剂迅速混匀。每份样本平均分为3份，1份用于立即检测血小板，另2份置于PVC袋中，迅速用热合仪密封，放入-80℃超低温冰箱保存备于以后检测。

    冻存1月时血小板形态的透射电子显微镜观察

    取冷冻保存1月的各组血小板，按以下方法操作：取1滴血小板悬液铺于有Formvar膜的铜网上，37℃温育8分钟，用Tyrode氏液（137 mmol/L NaCl, 2.8 mmol/L KCl, 1 mmol/L MgCl2, 12 mmol/L NaHCO3, 10 mmol/L HEPES, 0.4 mmol/L Na2HPO4, 5.5 mmol/L Dglucose, pH 7.4）反复冲洗，自然干燥后置H600I型电子显微镜下观察，每个标本连续观察200个血小板，计数圆形、树突形和不规则形血小板的百分比。以未经冻存的新鲜血小板的电子显微镜观察结果为对照。

    血小板膜表面CD62P表达的流式细胞仪检测

    取未经冻存的新鲜血小板及冻存1月、3月时的各组血小板，按以下方法操作：将2 μl血小板悬液用TB溶液（137 mmol/L NaCl, 2.8 mmol/L KCl, 1 mmol/L MgCl2, 12 mmol/L NaHCO3, 10 mmol/L HEPES, 0.4 mmol/L Na2HPO4, 0.35% BSA, 5.5 mmol/L Dglucose, pH 7.4）稀释至浓度为（1.0-2.0）×107/L。在聚苯乙烯试管中事先加入2.5 mmol/L GPRP和0.8 μg/ml的CD62PPE单克隆抗体，分别加入30 μl稀释血小板和终浓度为1 U/ml的牛凝血酶，37℃孵育15分钟以确保CD62P的表达。以PE标记的同型单克隆抗体为对照。加入等体积的1％多聚甲醛22℃固定20分钟，再加入300 μl  TB缓冲液，用流式细胞仪585 nm波长的滤过频带检测PE荧光。用流式细胞仪自带的CellQuest软件分析结果。

统计学分析

    采用SPSS 11.0统计软件对数据进行ANOVAoneway LSD分析，比较不同组间的差异。结果用均数±标准差（±SD）表示。

    结    果

    透射电子显微镜下血小板形态变化

    低倍视野下观察显示：新鲜血小板形态和密度较一致，多为类圆形，内部颗粒分布均匀，结构清楚，部分活化的血小板可见有小的伪足。冷冻保存1月时的血小板形态变化较多，外形不规则，可见较多伪足，空泡增多，不同血小板间密度相差大，个别血小板内部结构消失。3种保存液冻存1月时的血小板均出现这些变化。高倍视野下观察单个血小板的形态结构，发现冷冻后的血小板膜相对完整，颗粒减少且相对集中，空泡较多，糖原颗粒增加，聚集成堆，有细长伪足形成。5% DMSO组个别血小板内部结构*消失。结果见表1。由表1可见，不同冻存液保存的血小板构成比之间的比较显示：圆形血小板百分比在A组减少明显，较其他组差别显著（P<0.01）。而B和C组与新鲜血小板相比变化不大。3组间树突形血小板构成无显著差异（P>0.05）。冷冻所致的不规则形血小板在A组较其他2组多（P<0.01），后两者之间没有明显差异。可见冷冻对血小板形态有影响，表现为圆形血小板的减少和出现不规则形血小板，B组和C组保护作用优于A组。

    CD62P的表达

    CD62P即P选择蛋白存在于血小板内α颗粒内膜表面，当血小板活化发生释放反应，CD62P在血小板膜上表达，而且分泌后不会被重新摄入，因而是反应血小板活化的重要指标。冷冻可导致血小板的活化，使其复苏后的功能受损。当再次受到刺激时活化率降低，影响其功能［4］。我们对不同低温保存液冷冻保存1月和3月时的血小板，分别给予凝血酶刺激，通过检测CD62P的表达来反应其活性。结果见表2、附图。 由表2可见，①未经冻存的新鲜血小板在凝血酶刺激前、后CD62P的表达有显著差异(P<0.001);②冷冻保存前、后（1月和3月时）的血小板在凝血酶刺激后CD62P的表达相比有显著差异，3种保存液保存的血小板与新鲜时相比P值均<0.001。冷冻保存后的血小板（无论保存1月还是3月）在凝血酶刺激后CD62P的表达降低;③保存1月和3月时比较，各组内无显著差异;④保存1月时各组间比较，A对B组，P=0.187；B对C组，P=0.605；A对C组，P=0.417。这些结果说明在冷冻保存1月时，3种不同保存液保存的血小板在凝血酶刺激后CD62P表达无显著差异;⑤保存3月时各组间比较，A对B组，P=0.339；B对C组，P=0.222；A对C组，P=0.785，这些结果说明在冷冻保存3月时，3种不同保存液保存的血小板在凝血酶刺激后CD62P表达也无显著差异。
  
　　讨    论

    目前5%-6%的DMSO仍为临床常用的血小板冷冻保存剂，但使用血小板时需洗脱DMSO以减轻其毒性［5］, 这一步骤费时费力且需要控制冷冻的速率和特殊的设备。因此国内对新的血小板保存方法进行了研究［6］。

    为了解决血小板低温下被活化而导致无法长期保存的难题，1996年Connor等［7］研制了一种称为thrombosol的试剂，它能与血小板内的第二信使效应物结合，特异地抑制血小板活化传导通路。Thrombosol 由阿米洛利、腺苷、硝普钠构成。 阿米洛利是一种离子通道阻滞剂，通过抑制Na+/H+交换有效限制Ca2+ 内流，从而减少血小板损伤。腺苷作用于血小板膜上特异性A2受体，活化腺苷酸环化酶，使cAMP和cGMP水平升高，减弱血小板的聚集。硝普钠通过释放NO来发挥其生物活性作用，NO可抑制血小板的黏附、聚集,且其抑制作用短暂而可逆。VadhanRaj等［8］以2% DMSO和thrombosol为血小板冷冻保存液，于-80℃低温下保存，使血小板保存期延长至3-6个月。

    在生理状态下，脾脏是机体破坏清除血小板的主要场所,而冷冻血小板多数在肝脏内被快速清除。血小板膜表面糖蛋白Ib（GPIb）是主要的血小板黏附受体，与血管受损处堆积的活性vWF结合，发挥黏附作用。冷冻使血小板膜上的GPIbα聚集成簇，且血小板复温后这种构象改变仍不可逆。CR3在肝巨噬细胞膜上高表达，可识别聚集成簇GPIbα，介导肝巨噬细胞对血小板的吞噬清除。vWf、CR3与GPIbα上的不同结构域结合。用UDP半乳糖选择性的修饰位于GPIbα寡糖链N端暴露的βN乙酰氨基葡萄糖残基，既可以阻断CR3的识别使血小板不被肝巨噬细胞吞噬，又不影响血小板的黏附功能。血小板产生的半乳糖转移酶足够催化半乳糖化反应，因此只需简单加入UDPGal与血小板共同孵育即可使GPIbα被半乳糖化修饰。Hoffmeister等［1］用UDPGal修饰小鼠血小板GPIbα成功阻止血小板在体内循环被快速清除。该血小板在4℃保存12天，且不影响其功能。本实验在低温冷冻保存液中加入UDPGal，以期解决冷冻血小板在体内被快速清除的难题。如前所述，Hoffmeister等用UDPGal修饰小鼠冷冻血小板的实验是在4℃下进行的，无需添加低温保护剂。但是当低温保护剂存在的条件下，UDPGal对其保护作用有何影响却尚未见相关的报道。

    我们对不同低温保存液冷冻保存的血小板用电子显微镜观察其形态，发现与5%　DMSO组冻存相比，用 2%　DMSO+thrombosol组和2%　DMSO+thrombosol+UDPGal组对血小板的保护作用较优，表现为冷冻所致的不规则形血小板少，而正常圆形血小板的比例与新鲜血小板相比差别不大，后两组之间没有明显差异。我们对不同冻存液保存后1、3月的血小板，给予凝血酶刺激，检测CD62P的表达发现，与新鲜血小板相比冻存血小板受凝血酶刺激后表达CD62P均有明显下降，与保存时间无明显关系。对各保存液在1月与3月时前、后自身对照研究发现凝血酶刺激后CD62P的表达无明显变化，即低温冷冻保存的时间长短（至少3月内）对血小板功能无显著影响。保存液5%　DMSO组、2%　DMSO+ thrombosol 组和2% DMSO+ thrombosol+UDPGal组间CD62P的表达无明显差异。

    综上所述，本实验显示2% DMSO+thrombosol及2% DMSO+thrombosol+UDPGal保存液对保持血小板形态比单用5% DMSO好，而体外功能检测CD62P活性显示三者无明显差别。同时发现在保存液中添加UDPGal对保存效果没有影响。由于5% DMSO保存液存在毒性作用需要洗脱，且冷冻保存时需控制降温速度等缺点，与之相比2% DMSO+thrombosol保存液具有明显优势。而对冷冻血小板进行半乳糖化修饰更是可以解决冷冻血小板在输注后体内快速被清除的难题，使其临床应用不再受限。

【参考文献】
  1 Hoffmeister KM, Felbinger TW, Falet H, et al. The clearance mechanism of chilled blood plaets. Cell, 2003; 112: 87-97

2Murphy S. Preparation and storage of plaet concentrates. In: Rossi EC, Simon TL, Moss GS, Gould SA, editors. Principles of Transfusion Medcine. 2nd ed. Baltimore: Williams & Willkins. 1996： 245-256

3Hogge DE, McConnell M, Jacobson C, et al. Plaet refractoriness and alloimmunization in pediatric oncology and bone marrow transplant patients. Transfusion, 1995; 35: 645-652

4Currie LM, Lichtiger B, Livesey SA, et al. Enhanced circulatory parameters of human plaets cryopreserved with secondmessenger effectors: an in vivo study of 16 volunteer plaet donors. Br J Haematol, 1999; 105: 826-831

5Bock M, Schleuning M, Heim MU, et al. Cryopreservation of human plaets with dimethyl sulfoxide: changes in biochemistry and cell function. Transfusion, 1995; 35: 921-924

6曹伟，王艳，靳鹏等.冷冻干燥血小板保存技术研究. 中国实验血液学杂志，2005； 13：883-888

7Connor J, Currie LM, Allan H, et al. Recovery of in vitro functional activity of plaet concentrates stored at 4 degree C and treated with second messenger effectors. Transfusion, 1996; 36: 691-698

8VadhanRaj S, Kavanagh JJ, Freedman RS, et al. Safety and efficacy of transfusions of autologous cryopreserved plaets derived from recombinant human thrombopoietin to support chemotherapyassociated severe thrombocytopenia: a randomised crossover study. Lancet, 2002; 359(9324): 2145-2152